新藥研究的微生物問題-微生物荷載及洋蔥伯克利不同于微生物限度

1、什么是微生物負荷與微生物限度？

生物負載（微生物負荷）是指產品和/或無菌屏障系統上或其中的存活微生物的總數，是多種微生物污染源所產生的微生物總和，這些微生物污染來源包括原料藥、輔料、生產設備、生產環境、生產工藝、生產用水和成品的包裝材料等，是一種定量方法。

微生物限度：微生物限度檢測是一個控制項目，涉及到產品最終質量標準的制定，是一種對非無菌產品進行定性和定量的方法。

2、微生物負荷與微生物限度有何主要區別？

在生物負載測試中，總活菌計數是作為一個整體來計算，而在微生物限度檢查中，需要分別對需氧菌、霉菌和酵母菌、特定微生物分別計數。

3、微生物負荷與微生物限度檢測方法有何異同？

兩者都需要對檢測方法進行適用性方法驗證，區別主要在于（1）、試驗菌株陽性菌有所不同。都需要使用5種菌株進行適用性試驗，但微生物負荷還需要用到需氧菌芽孢（枯草芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌）（2）、供試品樣品制備不同。微生物負荷需要考慮樣品取樣，微生物采集方法，回收率一般不超過100%，而微生物限度回收率要求一般為50%-200%（3）控制菌檢查要求不同。微生物限度根據產品物料性質、使用用途不同，控制菌的檢查要求不同，而生物負載要求無菌產品中間產品不得檢查耐熱菌，如有檢查需要進行耐熱菌沸水測試，D值鑒定，必要時候需要進行菌種分離鑒定。（4）檢驗結果不同。微生物限度檢查需要分別對需氧菌、霉菌酵母菌、控制菌進行計數報告，與產品放行直接相關。而生物負載測定只需要計入總數，與無菌保證水平相關。

4、中國GMP無菌藥品附錄中有關于微生物控制的相關描述嗎？

附錄中，第三章第十一條：應當對微生物進行動態監測，評估無菌生產的微生物狀況。監測方法有沉降菌法、定量空氣浮游菌采樣法和表面取樣法（如棉簽擦拭法和接觸碟法）等。動態取樣應當避免對潔凈區造成不良影響。成品批記錄的審核應當包括環境監測的結果。

對表面和操作人員的監測，應當在關鍵操作完成后進行。在正常的生產操作監測外，可在系統驗證、清潔或消毒等操作完成后增加微生物監測。

第十章 生產管理第五十二條：應當盡可能減少物料的微生物污染程度。必要時，物料的質量標準中應當包括微生物限度、細菌內毒素或熱原檢查項目。

第五十八條  應當根據所用滅菌方法的效果確定滅菌前產品微生物污染水平的監控標準，并定期監控。必要時，還應當監控熱原或細菌內毒素。

第十四章 質量控制第八十條：無菌檢查的取樣計劃應當根據風險評估結果制定，樣品應當包括微生物污染風險最大的產品。

5、最終滅菌產品微生物負荷應該如何監測？

在《中國新GMP指南：無菌制劑》中：應該依據所采用滅菌/除菌方法的有效性和熱原污染的相關風險，制定滅菌前微生物負荷的控制標準，必要時應制定滅菌前熱原或細菌內毒素控制標準。控制滅菌前微生物污染水平是控制產品熱原污染的主要手段。最終滅菌產品一般采用的標準如下：企業可以根據自身情況制定滅菌前藥液的微生物負荷標準，原則是確保每個容器在滅菌后無菌保證水平達到1 0 ^-6。微生物負荷標準的制定應有依據和理由，常見的如每100ml藥液中污染菌不超過lOOcfu ( 有些企業以單位容器來規定限度），當以體積數制定標準時，針對體積較大的產品（如透析液），需要根據產品規格制定相應的標準。

6、最終滅菌產品微生物負荷取樣方法、取樣量有何規定？

滅菌前微生物污染水平監測的取樣應考慮正常生產的整個過程，應基于風險評估選取最有代表性的樣品，且要充分考慮到產品從灌裝到滅菌前的放置時間。

通常灌裝后段配制藥液儲存的時間最長，微生物滋生的風險增加，應對灌裝后段產品進行取樣，監測微生物污染水平。如果灌裝持續時間較長，根據驗證結果確定取樣的時間和頻率，如從每批產品灌裝開始、中間及結束時分別取樣，取樣量一般不少于100ml。

7、最終滅菌產品微生物負荷批檢驗頻率有何規定？

采用過度殺滅法的滅菌工藝經過風險評估以適當的頻次進行監測；采用殘存概率法的滅菌工藝，為確保每一單元容器生物負荷符合要求，應當對每一批藥液進行監測，同時應根據滅菌前微生物污染水平監測結果開展污染菌耐熱性檢查。

8、最終滅菌產品微生物負荷測試方法是什么？

參考《中國藥典》非無菌檢查方法，使用經驗證過的檢驗方法定量過濾藥液，若樣品有抑菌性，應根據企業開發的方法，對抑菌性進行處理，如采用中和劑沖洗，將此濾膜移至胰酪大豆蛋白胨培養基瓊脂平板上，在30〜3 5 ℃培養3〜5 天，計數。

耐熱性檢查：對于滅菌前微生物污染水平監測中發現有污染菌的產品，應采用合適的方法對疑似存在的耐熱菌進行耐熱性測試，如沸水測試或D 值測定。

8、何時進行微生物D值測定，測定方法是什么？

經確認為耐熱菌，可考慮進行微生物D 值測定，測定方法有殘存曲線法和陰性分數法。具體可參考《中國藥典》通則9208生物指示劑耐受性檢查法指導原則。

9、非最終滅菌產品微生物負荷如何規定的 ？

最終除菌過濾前非最終滅菌產品微生物的限度標準一般≤10cfu/l00ml。

10、非無菌原輔料、化學藥品微生物控制策略應該如何制定？

建議參考國家局CDE《非無菌化學藥品及原輔料微生物限度研究技術指導原則》。

11、什么是洋蔥伯克霍爾德菌群？

洋蔥伯克霍爾德菌群（Burkholderia cepacia complex，Bcc）是一類來源廣泛、由20余個伯克霍爾德菌屬的近緣種組成的革蘭氏陰性條件致病菌，具有較強的耐藥性。對于某些水性基質非無菌化學藥品，Bcc是不可接受微生物。對于吸入用途的非無菌制劑以及口服、黏膜、皮膚和鼻腔給藥的水性基質非無菌制劑，應參照相關技術要求對洋蔥伯克霍爾德菌群進行風險管理和控制研究，制定相應的控制策略，必要時將Bcc訂入產品放行/注冊標準（登記標準）。

12、為什么需要控制洋蔥伯克霍爾德菌群？

洋蔥伯克霍爾德菌是一種機會性病原體，主要在免疫功能低下的人群中引起疾病。易感染的特定人群包括老年人、幼兒、癌癥患者、孕婦和慢性病患者。雖然洋蔥B.cepacia在完全干燥的表面上似乎不能存活超過一周，但它可以在水中存活數月。這種微生物能夠在惡劣條件（例如有機溶劑、防腐劑、低營養物質等）下存活數月。參照PDA TR67中：“表2：與產品召回、非無菌制劑引起的感染及臨床感染相關的常見微生物種類”，與洋蔥伯克霍爾德菌有關的產品召回事件在所有召回事件中（N=144）占據首位（出現34次），也占據著大眾視野。該菌已經被美國FDA列為不可接受微生物。從產品召回中吸取公共衛生問題的教訓，通過評估有16次代表性的召回與BCC污染相關的。6次召回是根據FDA的調查結果自愿發起的，10次為企業自愿召回。產品類型包括洗眼液、鼻噴霧劑、漱口水、防齲漱口水、護膚霜、嬰兒和成人用毛巾、手術用準備布、電解質溶液和不透射線制劑。BCC甚至在含有一種或多種抗菌防腐劑的情況下也對這些產品進行了污染，所用的防腐劑有苯扎氯銨、氯化十六烷基吡啶、葡萄糖酸氯己定、檸檬酸、重氮唑烷基脲、過氧化氫、乳酸、對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀、對羥基苯丙酯、硝酸鈉，這些抗菌成分是藥物制劑中的常見成分，從高效到溫和的抑菌或殺菌活性不等。雖然似乎沒有一類或一組抗菌化合物特別有利于BCC的耐藥性，但這些物種能夠在常見的藥物防腐劑存在下持續存在。

13、洋蔥伯克霍爾德菌群有耐藥性嗎？

BCC是多藥耐藥菌。BCC細菌的多重耐藥性似乎是由于各種外排泵有效地從細胞中去除抗生素，由于BCC形成生物膜的能力，抗生素與細菌細胞表面的接觸減少，以及細胞膜的變化降低了膜對抗生素的滲透性。BCC也對許多消毒劑和清潔劑有抵抗力，并且不受包括聚維酮碘在內的許多防腐劑的影響。BCC是臨床實驗室中遇到的最具抗微生物藥物抗性的微生物之一。這些菌株通常對所有已知的抗微生物劑具有抗性。具體來說，制造商不能依靠防腐劑來控制BCC。但可以通過其他可靠的方法解決污染問題，例如過程控制和無菌產品制造。為了防止這種機會性和適應性病原體的風險，制造控制措施必須不僅包括有效的清潔、消毒和干燥設備，但也必須將幾乎任何水源都視為潛在的污染源。水是制藥生產中最常見的原材料，而飲用水是BCC的常見來源。制藥用水的處理和保存方式可以最大限度地減少微生物數量、內毒素以及有機和無機化合物。BCC耐藥現狀表現為，對氨基糖苷類抗生素和多粘菌素等高度耐藥(耐藥率普遍高于94％)，對氯霉素和磷霉素也有較高的耐藥率(大于60％)；半合成青霉素中的阿莫西林、氨芐西林、阿莫西林+克拉維酸和第一、二代中的頭孢菌素中的頭孢噻吩、頭孢呋辛及單環β-內酰胺類氨曲南的耐藥率高(耐藥率大于50％)，對哌拉西林、哌拉西林+他唑巴坦、第三代頭孢菌素中的頭孢他啶、頭孢哌酮+舒巴坦和復方新諾明的耐藥率均較低；對米諾環素和美羅培南較敏感。

14、洋蔥伯克霍爾德氏菌的菌落特征、生理生化特征是什么？

曾命名為Pseudomonas cepacia，革蘭氏陰性桿菌，嚴格需氧，細胞大小0.8-1.0×1.6-3.2μm，單獨或成對存在，可通過極性鞭毛運動。最適生長溫度為30-35℃，4℃不生長，幾乎所有菌株都可在40℃生長，大多數菌株可在41℃生長。氧化酶陽性，但反應時間較長且反應較弱。可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。分離自腐爛的洋蔥、土壤以及各種臨床樣本。

15、怎樣用16S rDNA基因測序鑒定洋蔥伯克霍爾德氏菌？

分離純化 、核酸提取、 PCR擴增、核酸擴增產物的檢測、擴增產物的純化、核酸測序、數據庫比對、確認鑒定結果

16、替代微生物檢驗分析方法驗證需要做哪些內容？

建議參考USP<1223>微生物替代法驗證、EP5.1.6  控制微生物質量等章節對非傳統微生物方法進行方法開發驗證。

17、PCR和MALDI-TOF質譜鑒定微生物的原理是什么 ？

將基因擴增法和質譜法結合使用可以用來檢測特定微生物和進行微生物鑒定。PCR首先在一個或多個目標序列中使用引物和探針。在一個系統中，PCR擴增的序列或擴增子被轉移到硅膠條或MALDI-TOF質譜上。在分離的系統中，擴增子被引入到電噴射離子-TOF質譜中�；�于的核酸成分和長度不同，擴增子被電離后，它們會進入檢測器中，將最終的圖譜與信息庫中已知的微生物的圖譜進行對比。此項技術可以用來檢測包括病毒的更廣泛的微生物，在單個樣品中可以檢測多種微生物。

18、什么是基因序列測定？

基因序列測定用于細菌、酵母菌、霉菌和支原體多種微生物的鑒別。其科學原理是當PCR擴增后，為特定的DNA的核苷酸堿基排序。通常，使用16S rRNA前500對堿基，但是為了得到更精確的結果也使用全部的16S rRNA。

首先從細胞的純培養物中將DNA提取后，然后通過PCR擴增；擴增需四種脫氧核苷酸堿基：腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）。然而，使用這些標準的核苷酸和雙脫氧核糖核苷酸的混合物時，后者在其脫氧核糖糖上缺乏3’-羥基。因此，在擴增反應中，當有雙脫氧核糖核苷酸被結合時，PCR引物的擴增將終止。因此DNA片段的長度會有不同。由于每個雙脫氧核糖核苷酸標有不用的熒光染料，就形成了標有熒光擴增序列的副本。這些副本的分子重量不同，因此可以使用毛細管電泳法對其進行分離和檢測。通過同時分析代表四個脫氧核苷酸堿基的四個反應混合物，基因序列軟件會將對所要分析的序列進行線性重組。把最終的序列與信息庫中已知的微生物序列進行對比，如果序列匹配，即可作為種屬的鑒別。